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白酒香气物质研究的方法学
浏览次数:790发布日期:2020-03-11

摘自《食品科学技术学报》

 

范文来,男,研究员,主要从事酿酒工程与发酵工程方面的研究。

 

我国白酒风味物质研究始于1964年茅台酒的第2次试点。1964年10月采用纸上层析法研究酱香型白酒窖底香气微量成分,当时一个斑点呈现窖底香,经鉴定是己酸乙酯,并进行了添加实验确认。1955年di一台商业化气相色谱(gas chromatography,GC)出现,1967年将GC应用于我国白酒微量成分研究 。1964年Fuller等发明了气相色谱-闻香技术(GC-olfactometry),将GC的化合物分离性能与人的鼻子闻香结合起来,从此,食品风味研究取得了突飞猛进的发展。但直到2005年GC-O技术才应用于我国白酒风味研究。笔者曾经对风味研究方法及香气物质研究有过回顾,江南大学生物工程学院酿造微生物学及应用酶学研究室的范文来, 徐岩拟回顾GC-O技术应用于白酒研究的方法学,包括总体研究思路、闻香技术、香气成分定量技术以及香气重组与缺失技术,以期对酒类香气成分研究有所启发。

1 白酒香气总体研究思路

白酒香气研究的方法与食品风味研究方法[11-12]类似,但又有其自身特点。主要包括以下几个主要方面。

一是香气物质提取。香气物质提取方法目前主要使用的还是经典的液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)方法,白酒中大部分香气物质是极性较强的化合物,因而常用萃取剂是乙mi、二氯甲烷、氟利昂或它们的混合物[13-21],当然也有使用顶空固相微萃取(head-space solid phase microextraction,HS-SPME)作为样品提取的方法[6],但由于该方法在萃取物极性方面上的局限,因而较少使用。

白酒LLE的关键是酒精对萃取物的影响。研究表明,高度白酒必须稀释后才能有效萃取,稀释后的酒精度是10%vol~14%vol[6,13-14,18]

为防止水可能带入的气味物,风味研究全过程使用的水为超纯水(Milli-Q),且将水加热煮沸5 min,冷却后使用。

为防止洗涤剂带入的气味物,必须使用无味洗涤剂浸泡实验用玻璃器皿1~2d,再按常规方法清洗。清洗后的玻璃器皿再用煮沸冷却后的超纯水洗涤3次,进行烘干,不能高温烘干的材料,常温晾干。

二是香气物质分离。白酒微量成分含量十分丰富,多达千种[22-23],已经鉴定出的化合物达698种[23-24]。在闻香过程中,可能会出现化合物GC峰重叠,造成香气重叠;或某些化合物香气太强,而掩盖了香气较弱的化合物。因此,通常会将萃取后的有机相再进行分离,或称为分馏(fractionation)。如将萃取后的有机相分为酸性组分(acidic fraction,AF)、碱性组分(basic fraction,BF)、水溶性组分(water-soluble fraction,WSF)和中性组分(neutral fraction,NF)[17-18],或分为AF、WSF、中碱性组分(N/BF)[16,21],或分为酸性-水溶性组分(A/WF)和N/BF[13-14,19-20,25-27]。但由于中性组分或中碱性组分仍然比较复杂,即化合物众多,此时,还可以采用正相色谱技术(normal-phase liquid chromatography,NPLC),根据化合物极性将其再细分为多个亚组分(subfraction)[13,18]。如在洋河大曲研究时,N/BF组分化合物多,采用硅胶60(silica gel 60)吸附N/BF组分香气成分,分别使用V(戊烷)∶V(乙mi)=98∶2、95∶5、90∶10和0∶100混合液洗脱成4个组分[13]。在进行茅台酒和郎酒研究时,分别使用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30和0∶100混合液洗脱成6个组分[18]。在研究药香型白酒香气和萜烯类化合物时,将N/BF组分使用硅胶柱分别用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50和0∶100混合液洗脱出7个组分[19,28]。如此形成的AF或A/WF、BF、NF或N/BF、水溶性组分,或者加上NPLC的亚组分分别进行闻香。

三是活性香气化合物(active-aroma compounds)发现。一个特定酒样中,什么技术可以检测哪一个化合物对香气有贡献呢?通常认为是GC-O技术[5],又分为精灵分析(CharmAnalysis)法[29]、香气萃取稀释分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)法[12,30]、香气萃取浓缩分析(aroma extract concentration analysis,AECA)法[31]、Osme技术(Osme techniques)[32]等。这些技术能检测到可能呈香的化合物,再与GC-氢火焰离子化检测器(GC-flame ionization detector,GC-FID)或GC-质谱检测器(GC-mass spectrometry,GC-MS)技术结合后,就可以进行香气化合物鉴定。

香气化合物的鉴定需要使用标准品进行确认,即当未知化合物香气特征、色谱保留时间(retention index,RI)[33]以及质谱信息与标准品完全一致时,即可确认。通常情况下,需要使用二个极性不同的色谱柱(如极性和非极性色谱柱)进行确认[13-14,34-35]

四是重要活性香气化合物确认。应用Charm-Analysis、AEDA和Osme技术能够发现最重要的风味化合物,但由于检测到的这些化合物呈现的是在空气中的香气强度,与原白酒样品中实际香气强度有区别,因此,通常使用气味活力值(odor activity value,OAV)的大小来表征其重要程度。OAV是指气味化合物浓度与其对应介质中气味阈值的比值[12,36]。OAV越大,说明该香气化合物越重要[37-39]。化合物浓度的测定在本文第3节香气成分定量技术部分讨论。

为此,需要测定这些香气化合物在白酒中的气味阈值。首次大规模测定白酒香气化合物阈值文章发表于2011年,当时组织国家ji评酒员测定了79个香气化合物在φ=46%酒精水溶液中的气味阈值[40],其后,不少研究人员又陆续测定了一些化合物的阈值。到目前为止,据不完全统计共测定了143种化合物气味阈值,包括32种酯类、15种醇类、15种醛类、2种缩醛、5种酮类、14种脂肪酸、9种吡嗪、7种呋喃类、16种芳香族、14种酚类、4种内酯、6种含硫化合物和4种萜烯类化合物的阈值[25, 35, 40-43]

五是关键香气化合物确认。OAV最大的化合物是不是关键香气需要进行验证。其一是选择一些OAV较高的化合物,进行香气重组(recombination)或香气重构(reconstitution),建立香气模型。如果重组后的整体香气与原有酒样不一样,或相似度不高,则需要从香气物质提取开始重新实验;其二是通过缺失实(omission test),确定关键风味成分。如果缺失某个化合物后,整体香气与原有研究酒的香气不同,则该化合物为关键香气化合物[34-35, 44] 

2 闻香技术

无论采用何种闻香技术,参加闻香的人员必须进行培训与选择[6,34]。AEDA闻香时通常需要2~3人,每个稀释度闻香6次(每人2~3次),只要有1人闻到香气就认可这个香气存在,计算其香气稀释因子(flavor dilution factor,FD值)[14,34-35]。而Osme技术中,主要使用香气强度。香气强度通常有6点刻度法(0~5)[45]和16点刻度法(0~15)[13]。“0”表示没有香气;中间点“3”或“8”表示香气强度中等;“5”或“15”表示香气zui强[13,45] 

2.1 AEDA法

AEDA方法由Grosch于1993年发明[12,30]。萃取浓缩后的样品与溶按VV=1∶1、1∶2、1∶3比例稀释,每一个稀释样品用GC-O闻香[11],结果用FD值表示。FD值是指最初萃取物中呈香物质浓度与该香味物质最稀时(GC-O仍能检测到)浓度比。因此,FD值是一个相对测量值,是化合物在空气中的OAV值。AEDA法已经在酒类风味研究领域得到广泛应用,如豉香型白酒香气研究[34]、洋河大曲新酒与老酒香气研究[6]、五粮液与剑南春香气研究[14]、清香型原酒香气研究[20] 

2.2 Osme技术

Osme一词来源于希腊语,意思为“闻香(smell)”。Osme技术由McDaniel等人开发[32]。该方法是萃取获得的样品,不经稀释,直接进行GC-O分析,记录香气强度。将感官品尝人员记录到的香气强度进行平均,即为香气强度值,此法又称为GC-香气强度法(GC-intensity)。Osme技术考虑了斯蒂文斯法则(Stevens’s Law)[3],它测量的是香气物质的时间-强度值(time-intensity)。该技术因耗时短,已经在白酒香气研究中获得广泛应用,如洋河大曲香气研究[13]、洋河绵柔型白酒香气研究[27]、清香型白酒(包括汾酒、宝丰酒和青稞酒)香气研究[35]、茅台与郎酒香气研究[18]、酱香型习酒和浓香型习酒香气研究[25, 46]、老白干香型白酒香气研究[16]、牛栏山二锅头香气研究[26]、宝丰酒香气研究[47]、药香型董酒香气研究[19]、豉香型白酒香气研究[48]、兼香型白酒香气研究[17]、白酒异嗅物研究[21]

3 香气成分定量技术

精确定量白酒中香气成分是件十分困难的事。白酒中香气成分众多,化学性质不一;浓度千差万别,从ng/L至g/L。因此,对白酒化合物定量通常需要几个方法结合使用。对浓度较高的化合物,如己酸乙酯(浓香型等香型)、乙酸乙酯、乳酸乙酯等(几百mg/L至g/L),通常采用直接进样GC-FID测定[25];而对于浓度较低的化合物(μg/L至几十mg/L),通常采用HS-SPME[25]或搅拌子吸附萃取技术(stir bar sorptive extraction,SBSE)测定[49]。而对于一些特殊化合物如含氮化合物,则采用专用检测器氮磷检测器(NPD)测定[50];另外一些化合物如反-2-烯醛类化合物需要衍生化后测定[34]

3.1 直接进样GC-FID

白酒中一些高浓度香气化合物可以采用此法测定,主要包括浓香型和酱香型白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、正丁醇、2-甲基丙醇(异丁醇)、3-甲基丁醇(异戊醇)[25];清香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯[35];豉香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇[34];芝麻香型白酒中的乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇和乙缩醛[39]。因测定的化合物大部分为酯类,故采用乙酸戊酯作内标[25,34-35]。该法还可以直接定量白酒中的乙醛与乙缩醛,此时使用辛醛-d16作内标[51]

另外一些化合物也可以采用GC-FID检测,如乙醛和乙缩醛,此时可用辛醛-d16作内标[51]

3.2 LLE和液液微萃取

LLE与GC-MS结合后可用于化合物定量分析,如地衣芽孢杆菌发酵液成分检测[52],高浓度硫化物检测等[53]

液液微萃取(liquid-liquid microextraction,LLME)是一种环境友好的技术[54]。LLME结合GC-MS采用选择离子法(selective ion monitoring,SIM)通常定量mg/L级化合物[25,55]。该法在酱香型白酒中可一次性定量48种香气化合物,包括酯类13种、醇类11种、酸类9种、芳香族化合物9种、呋喃类化合物4种、醛酮类1种以及吡嗪类化合物1种。乙酸乙酯、乙缩醛、丙酸乙酯因溶剂延迟无法定性与定量;乙醛因挥发性太强,无法使用LLME方法定量[55]。该法目前已经广泛应用于白酒定量中,如酱香型[25,55]、浓香型[25]、清香型[35]、芝麻香型[56]白酒。另外,因SPME萃取头对脂肪酸不敏感,故脂肪酸类化合物可以采用LLME法测定[39]

3.3 SPME结合GC-MS

SPME技术于1989年由Belardi和Pawliszyn[57]开发,已经被广泛用于食品风味物质研究[58],主要用于定量μg/L级化合物。该技术可用于以下分析:一种是顶空分析,即HS-SPME,2005年HS-SPME首次应用于白酒风味研究[6],后该技术结合GC-MS在我国白酒风味研究中获得广泛应用,如酱香型[18,25]、浓香型[25]、豉香型[34]、芝麻香型[39,59]白酒风味研究;白酒中异嗅物分析[21,60]

另外一种是浸入式SPME技术(direct immersion-SPME,DI-SPME)。2007年DI-SPME技术应用于我国白酒风味成分定量[61],后又应用于白酒中异嗅化合物[62]、游离挥发性酚类[63]以及挥发性香气物质[64]定量。

3.4 SBSE结合GC-MS

SBSE技术由比利时色谱研究所Baltussen和Sandra等[65-66]于1999年开发,与其类似的技术搅拌子顶空吸附萃取技术(headspace sorptive extraction,HSSE)则由Bicchi和Tienpont等[67-68]首先应用。SBSE技术已经广泛应用于食品分析中[69-73]。2011年,这一技术被用于酱香型茅台与郎酒的香气成分分析[49],一次可以定量76个挥发性成分,包括25种酯、10种醇、9种醛和酮、8种芳香族、5种呋喃、3种含氮化合物、6种脂肪酸、4种酚类、3种萜烯、1种含硫化合物、1种内酯和1种缩醛。

3.5 固相萃取结合GC-MS

固相萃取(solid phase extraction,SPE)己被公认为是一个非常有用的样品预处理技术,已经广泛应用于饮料酒成分分析中,如葡萄酒、威士忌、白兰地[74] 以及结合态风味化合物 [75-76] 研究中。SPE可以用于白酒香气成分预处理,即选择某一吸附材料,吸附白酒香气物质,再洗脱、浓缩后用于GC-O分析 [77] ;SPE结合GC-MS技术可以定量白酒中香气物质如定量8种内酯 [78] ,包括γ-丁内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯;或定量白酒中其他风味物质 [79] 

3.6 专用检测器测定技术

白酒中含氮、硫化合物,因FID或MS检测器响应不灵敏,需要使用专用检测器进行定性和定量。

氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector,NPD)可用于检测白酒中吡嗪类化合物[50]。NPD俗称碱火焰离子化检测器(alkali flame ionization detector,AFID)、热离子离子化检测器(thermionic ionization detector,TID)、火焰热离子化检测器(flame thermionic detector,FTD)、热离子化专用检测器(thermionic specific detector,TSD),于1964年被Karmen和Giuffrida发明[80]。应用GC-NPD并结合GC-MS,可以定性白酒中26种吡嗪类化合物,在有标准品的情况下能用于定量分析[50]

火焰光度检测器(flame photometric detector,FPD)是在FID基础上于1966年发明的[80],目前已经发展成为脉冲火焰光度检测器(pulsed flame photometric detector,PFPD)。GC-FPD/PFPD已经用于白酒硫化物检测[59,81-82],如GC-FPD可以测定白酒中近20种硫化物[81]。GC-PFPD可以检测茅台酒中13种硫化物[82]

3.7 衍生化测定技术

不饱和醛如反-2-烯醛和二烯醛是豉香型白酒重要香气成分[34],由于这些化合物含量低,常规方法无法检测,因此,需要衍生化后进行检测。使用O-(2,3,4,5,6-五氟苯)羟胺盐酸盐(O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride,PFBHA)作为衍生化试剂,p-氟苯甲quan作内标(p-fluorobenzaldehyde),HS-SPME结合GC-MS同时萃取衍生化可测定反-2-戊、己、庚、辛、壬烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-辛二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛等[83]

当然,由于羰基会与PFBHA反应,故该衍生化方法能定性白酒中53种羰基化合物,可定量除乙醛和丙酮外的51种羰基化合物,包括11种直链饱和脂肪醛、3种支链饱和脂肪醛、14种不饱和脂肪醛、8种饱和脂肪酮、6种芳香族羰基化合物、4种呋喃类羰基化合物以及5种其他羰基化合物[84-85]。与常规 HS-SPME定量方法相比,多定量43种化合物,检测限最低达到0.01μg/L,即10ng/L(反-2-庚烯醛)[85]

3.8 全二维气相色谱-飞行时间质谱技术

全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-GC-time of flight-MS,GC×GC-TOF-MS)于1985年由Phillips等[86-87]发明。这一技术解决了一维GC不能将众多化合物分离的问题。目前这一技术已经在白酒硫化物[88]、白酒风味成分[89]研究等方面得到应用。

4 香气重组与缺失技术

定量了活性香气化合物浓度,测定它们在φ=46%酒精水溶液中的嗅阈值,则可以计算出OAV值。将计算后的OAV值从大到小排序。在白酒香气重组时,通常忽略OAV小于1的化合物,而使用OAV大于1的化合物进行香气重组,如豉香型白酒香气研究中,共检测到56个活性香气成分,但仅采用34个OAV大于1的化合物进行重组[34];在清香型汾酒香气研究中,共检测到66个活性香气成分,仅采用27个OAV大于1的化合物进行香气重组[35];在浓香型剑南春酒香气研究中,共检测到126个活性香气成分[14],后选取40个化合物进行香气重组[44] 

当重组后的φ=46%酒精水溶液香气与最初的样品香气相似时,即可认为香气重组成功,此时,可进行缺失实验。缺失实验是将用于重组的化合物逐一省略,重组出少一个化合物的新样品,并逐一进行闻香判别。当某一化合物缺失后,重组样品的香气与原酒样差距大或有显著性差异时,即可认为该化合物是关键香气化合物[12] 

然而,由于白酒重组香气成分较多,逐一缺失时,会造成工作量特别是闻香工作量太大。故通常选择缺少一类化合物如酯类或醇类化合物。如果某类化合物缺失后,造成重组样品香气与原有酒样香气显著不同,则在此类化合物中再逐一缺失[34-35,44]

5 研究展望

目前,大部分香型白酒的活性香气成分已经得到广泛研究,但能够香气重组的香型并不多。或许,在样品预处理上仍然存在一些缺陷;或没有提取或分离出应该提取或分离的香气成分;或在GC-O阶段,某个香气组分的香气被其它成分所掩盖;或者这个香气成分处于闻香的后段,即化合物的RI值较高,且化合物不出峰,造成无法鉴定;或者这个香型的关键香气是几种香气化合物协同作用的结果。要解决这些问题,需要开发一些新的研究策略来研究这些白酒的活性香气成分。但不管如何,最后仍然需要定量、阈值测定、计算OAV,并进行香气重组与缺失试验。

参考文献:略(可点击原文查看)

范文来,徐岩.白酒香气物质研究的方法学[J]. 食品科学技术学报,2018,36(3):1-10.
FAN Wenlai,XU Yan. Methodology for aroma compounds in Baijiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,36(3):1-10.

基金项目:“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0400503)。

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